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Jan 01, 2024

Studie entschlüsselt den Biosyntheseweg des Antidepressivums Orcinolglucosid

Wissenschaftler haben auch die Produktion von Orcinolglucosid in der Region entwickelt

Wissenschaftler haben auch die Produktion von Orcinolglucosid in der biotechnologiefreundlichen Hefe manipuliert.

Die antidepressiven Eigenschaften von Orcinolglucosid (OG) sind gut belegt. Es kommt hauptsächlich im Rhizom von Curculigo orchioides Gaertn vor, auf Chinesisch auch als Xianmao bekannt. Zeugenaussagen zufolge hat OG vielfältige pharmakologische Wirkungen. Einigen Untersuchungen zufolge könnte der Hauptbestandteil von C. orchoides mit antidepressiver Wirkung OG sein.

Aufgrund der ineffektiven Pflanzenextraktion und der schwierigen und kostspieligen chemischen Synthese blieb die kommerzielle Anwendbarkeit von OG jedoch eingeschränkt.

Die hochaktive Orcinol-Synthase (ORS) und die UDP-abhängige Glykosyltransferase (UGT), die an der Produktion von OG beteiligt sind, wurden in dieser Studie mithilfe einer effektiven Screening-Pipeline entdeckt. Mithilfe der Transkriptomsequenzierung, Computeranalyse und In-vitro-Funktionsvalidierung von C. orchioides konnten Forscher den Signalweg genau bestimmen.

Die Biosynthese von OG wird zunächst durch ORS, eine Polyketidsynthase (PKS) vom Typ III, durch Kondensation von 1 Molekül Acetyl-CoA und 3 Molekülen Malonyl-CoA katalysiert, um Orcinol zu erzeugen, das anschließend am Kohlenstoff mit UGT modifiziert wird -3- oder Kohlenstoff-5-Hydroxygruppe, um OG zu erzeugen.

Wissenschaftler verwendeten metabolische und vergleichende Transkriptomanalysen, um die funktionellen Gene zu untersuchen, die ORS und UGT in C. orchioides kodieren. Sie untersuchten die Verteilung von OG und seinem Vorläufer Orcinol in den Wurzeln und Blättern von C. orchioides. Die Ergebnisse zeigten, dass OG hauptsächlich in den Wurzeln angereichert war, mit einer fast dreifach höheren Häufigkeit als in den Blättern. Gleichzeitig war auch der Gesamtgehalt an OG und Orcinol in den Wurzeln höher als in den Blättern.

Wissenschaftler konnten anhand der Sequenzähnlichkeit auch fünf ORS-Kandidaten anderer Arten identifizieren. Alle ORS-Kandidatengene wurden mithilfe von In-vitro-Enzymaktivitätstests mit Acetyl-CoA und Malonyl-CoA als Substraten charakterisiert.

Der UGT, der für die OG-Bildung in C. orchioides verantwortlich ist, ist weiterhin unbekannt. Durch die Integration von Transkriptomsequenzierung, eingeschränktem molekularem Docking und funktioneller Charakterisierung haben wir eine Pipeline konstruiert, um die für UGTs kodierenden Kandidatengene einzugrenzen. Durch die Einschränkungen der Genexpression und der Substratbindung wurden mehr als 90 % der potenziellen Kandidaten schnell eliminiert.

Die arbeitsintensive Funktionsvalidierung der UGT-Kandidaten wurde dann an nur sechs Genen durchgeführt, wodurch langwierige experimentelle Tests vermieden wurden. Dieser Prozess bietet eine Möglichkeit, neue Glykosyltransferasen und andere funktionelle Gene in den Biosynthesewegen natürlicher Pflanzenprodukte zu entdecken, was auch zum Aufbau der umfassenden pflanzlichen UGT-Datenbank pUGTdb angewendet wurde.

Um die mikrobielle Produktion von OG zu verbessern, berücksichtigten die Wissenschaftler hauptsächlich Wirtszellen, Stoffwechseltechnik, Medium und Fermentationsbedingungen. Der aufstrebende industrielle Mikroorganismus Y. lipolytica ist von Natur aus mit hohen Kohlenstoffflüssen in Richtung Acetyl-CoA und Malonyl-CoA ausgestattet. Beispielsweise verbesserte die Überexpression der endogenen YlPEX10- und YlACC1-Gene, die zur Verbesserung der Versorgung mit Acetyl-CoA und Malonyl-CoA verwendet wurden, die OG-Produktion nicht, was darauf hindeutet, dass die Vorläuferversorgung nicht der limitierende Faktor war.

Tatsächlich verbesserte die Überexpression nachgeschalteter Gene (CorcORS1 und CorcUGT31) im Biosyntheseweg von OG die Produktion von OG erheblich. Gleichzeitig stellten wir fest, dass die Wahl eines geeigneten Fermentationsmediums die Produktivität maßgeblich beeinflusste und entscheidend für die Reduzierung der Nebenproduktsynthese war.

Nach zusätzlicher Optimierung der Fed-Batch-Fermentationsbedingungen wurde die Produktivität von OG im gentechnisch veränderten Stamm YL-G12 im Vergleich zum Ausgangsstamm YL-G1 um etwa das Hundertfache verbessert.

Durch die Verbesserung des Downstream-Weges, des Stoffwechsel-Engineerings und der Optimierung der Fermentation wurde die OG-Produktion in Yarrowia lipolytica um das Hundertfache verbessert, was zu einer Endausbeute von 43,46 g/L (0,84 g/g DCW) führte, was fast 6.400-fach höher ist als die Extraktionsausbeute aus C. orchioides-Wurzeln.

Zeitschriftenreferenz: